茶树花不同发育时期的转录组分析

为了揭示茶树花不同发育时期生长发育和生化成分代谢的分子机制,以‘黄棪’茶树品种为研究对象,通过高通量测序技术对茶树花两个发育时期(花苞期、开放期)的转录组进行比较分析.结果显示:转录组测序共获得135 039 271个过滤序列,GC含量为44.30%～45.35%;茶树花两个发育时期共获得18 352个差异表达基因,其中,上调的基因有8 019个,下调的基因有10 333个.对差异表达基因进行基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,发现其主要富集在与茶树花生长发育、生化成分形成有关的植物激素信号转导、光合作用—天线蛋白、植物的昼夜节律、糖胺聚糖降解等代谢途径上.本研究结果表明,茶树花的发育受到植物激素的调控和光周期的诱导,与氨基酸、可溶性总糖有关的代谢途径随着花的发育发生了变化,该结果为进一步研究茶树花发育过程中的动态变化提供了参考.     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

[目的]木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一.紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源.因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点.模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子(NAC secondary wall thicking promot...     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子(NAC secondary wall thicking promoting factor)调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNSTCDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素(GA3),水杨酸(SA)和多效唑(PCB)诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成(60.83%);三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高(49%—55.9%),并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平(12h)分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素(13%)、总糖(7%)和木质素(11.7%)含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因(PAL,4CL等)及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

‘仓方早生’桃及其早熟芽变不同发育时期果实的转录组分析

【目的】通过对桃品种‘仓方早生’及其早熟芽变不同发育时期的果实进行转录组分析,挖掘参与调控桃果实成熟的关键因子,为深入研究桃果实成熟调控机理提供理论依据。【方法】以桃品种‘仓方早生’及其早熟芽变为试材,每个品种分别选择长势一致的样品树5株,分别于花后30 d（对应‘仓方早生’c1、早熟芽变y1）、45 d（对应c2、y2）、59 d（对应c3、y3）、71 d（对应c4、y4）及89 d（对应c5）对不同发育时期的桃去皮果肉进行取样和转录组测序,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对筛选的差异表达基因进行定量验证;利用GO和KEGG对‘仓方早生’及其早熟芽变的差异表达基因进行分析;基于差异表达基因构建加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）,从中鉴定出与果实成熟密切相关的枢纽模块和枢纽基因。【结果】将处于果实相同发育时期的转录组数据进行比较,得到y1与c1、y2与c2、y3与c4和y4与c5四组对比数据,共筛选出差异表达基因4 395个,其中上调表达基因2 212个,下调表达基因2 183个。其...     

大白菜花发育不同时期的转录组研究

[目的]研究大白菜花发育不同时期的基因表达变化,为进一步完善成花调控分子机理提供依据。[方法]利用Illumina HiSeq4000测序平台对大白菜花芽分化1级和5级的茎尖生长点进行转录组测序,比较花发育过程基因表达的差异。[结果]发现2 859个差异表达基因,且差异表达基因显著富集在苯丙素生物合成、苯丙氨酸代谢、黄酮类化合物生物合成、脂肪酸延长和植物昼夜节律这5条代谢通路上;研究表达差异倍数在10倍以上的基因功能,筛选出14个可能影响大白菜花发育的新基因。[结论]大白菜花发育过程苯丙素生物合成和苯丙氨酸代谢活动有所减弱,而黄酮类化合物生物合成、脂肪酸延长和植物昼夜节律活动有所增强;筛选出的14个基因可能在大白菜花发育过程有重要作用,可进一步研究。     

辣椒不同发育时期果实的转录组分析

[目的]广泛深入认识辣椒素生物合成的调控因素,为辣椒生物技术育种工作提供分子基础.[方法]对2个不同辣度的辣椒材料'754-3-1-1-1'和'渝椒5号'快速生长期(KS)和绿熟期(LS)的果实分别进行转录组测序,通过Cufflinks软件进行基因差异表达分析并利用荧光定量RT-PCR验证基因表达数据的准确性,比较2个...     

卵形鲳鲹卵巢不同发育时期的转录组测序分析

【目的】鉴定筛选出与卵形鲳鲹卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为揭示其卵巢性成熟过程的分子机制打下基础。【方法】挑选卵巢发育处于?期和Ш期的雌性卵形鲳鲹,分别构建卵形鲳鲹卵巢?期和Ш期的cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2500进行转录组测序,经过滤、质量控制及拼接组装后获得的Unigenes在七大数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO）中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行功能注释及信号通路富集分析,并采用MISA和GATK3进行SSR鉴定及SNP分析。【结果】卵形鲳鲹卵巢组织转录组测序获得的325156432条Raw reads,经过滤筛选得到317206752条Clean reads,拼接组装后得到59554条Unigenes;69.65%的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等七大数据库中注释成功,其中有24599条Unigenes被注释到GO数据库,15997条Unigenes被注释到KEGG数据库。在卵形鲳鲹卵巢组织的2个发育时期共鉴定获得56115个基因,经差异表达分析后获得17737个差异基因,其中8169个基因在卵巢Ш期上调表达、9568个基因在卵巢Ш期下调表达。GO功能注释分析发现,卵形鲳鲹卵巢差异表达基因主要注释在细胞过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、核、核部分、离子结合及水解酶活性等条目上;而KEGG信号通路富集分析结果显示,17737个差异表达基因显著富集在318条代谢途径上,其中前20条KEGG信号通路包括2-氧代羧酸代谢、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酶D信号通路、Fc εRI信号通路和细胞周期等。卵形鲳鲹卵巢转录组（59554条Unigenes）中共存在30133个SSRs和82490个SNPs。【结论】GnRHR、FSHR、FSHβ、CYP11A、SIRT3和PEG3等差异表达基因及PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路等与卵形鲳鲹卵巢的发育密切相关,共同调节卵巢的发育与成熟,在卵巢性成熟过程中发挥重要作用。     

芳樟叶片转录组测序及萜类合成调控相关基因表达分析

通过Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术对芳樟和杂樟（对照）叶片进行转录组学测序分析,并对所涉及的Unigene在GO、Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss−prot和KEGG中进行分类、功能注释和Pathway注释。结果表明：2类樟树叶片转录组检测共产生34.45 GB clean数据,组装了312 457个Unigene。其中,11 685个Unigenes鉴定为芳樟叶和杂樟叶的差异表达基因,在芳樟中6 481个被鉴定为上调的Unigenes和5 204个为下调Unigenes;对其进行GO功能富集发现并鉴定了编码萜类合成酶Unigenes 39个,包括单萜生物合成6个,二萜生物合成7个,倍半萜和三萜生物合成12个,萜类骨架合成14个。对萜类合成酶TPS14基因进行转录组FPKM和q−PCR验证发现,其表达量在芳樟中较杂樟更低,可能与其转录过程的选择性剪切有关。通过SSR位点分析,从88 016个Unigene中共检测到134 851个SSR位点,其中单个SSR位点有103 478个Unigene,含2个及2个以上SSR位点有31 373个Unigene。     

紫花苜蓿小孢子发育时期与花器形态的相关性研究

[目的]研究紫花苜蓿小孢子各发育时期细胞学特征与花器形态之间相关性,依据花器形态来判断小孢子发育时期,为小孢子培养诱导单倍体的提供依据.[方法]以5个品种紫花苜蓿为供试材料,观察小孢子不同发育时期细胞学特征及花蕾形态、花药大小、颜色及形态.[结果]紫花苜蓿小孢子的发育的四个时期(四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期)细胞学特征明显;紫花苜蓿小孢子发育时期与花蕾形态特征密切相关,花蕾纵径、横径和花瓣长增长显著,同一品种四个时期存在极显著差异;亮牧1号花蕾纵径长度在小孢子发育的四个时期大于其它4个品种的相应时期;同一时期参试品种间花器形态差异不显著;品种内四个时期花药大小变化不显著,花药颜色变化明显,由绿色逐渐变为黄色.[结论]花蕾纵径、横径和花瓣长适合作为小孢子发育时期的判断指标;紫花苜蓿小孢子处于单核靠边期时,纵径长在5.40～6.10 mm,横径长在1.61 ～1.85mm,花瓣长在3.98 ～ 5.55 mm,此时花瓣露出萼片,花瓣呈紫色,花药为淡黄色.     

比较转录组分析揭示花生种皮花青素积累的分子调控机制

花青素作为一种抗氧化物质,具有多种保健功效。与其他颜色花生相比,黑种皮花生具有良好的感官品质,且花青素含量更高。为了揭示花生黑种皮花青素形成和调控的分子机理,本研究以黑种皮花生(YH29)和粉红种皮花生(WH10)为研究对象,通过RNA-seq技术比较其转录组的差异。结果表明,与粉红种皮花生相比,黑种皮花生中1 539个基因表达上调,1 275个基因表达下调。KEGG分析发现花青素生物合成、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等多个与色素积累相关的通路在黑色种皮花生中富集。在黑种皮花生中,苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶等5个与花青素合成相关的关键酶基因表达上调,而与花青素生物合成途径竞争同一底物的一些关键酶基因,如柚皮素和甘草素基因,则表达下调,这使得有更多的底物流向花青素合成途径,这些基因的协同表达可能是黑种皮花青素高水平积累的关键。另外,两个R2R3-MYB转录因子在黑种皮花生中也表达上调,可能是引起花青素合成关键基因表达差异的关键因素。我们的研究结果为深入研究花生种皮花青素合成的分子机理及培育高花青素含量的花生新品种提供了参考。     

不同紫花苜蓿品种对低磷环境的形态与生理响应分析

【目的】筛选耐低磷苜蓿品种及与耐低磷密切相关的性状指标,进一步为紫花苜蓿耐低磷机制研究和生产应用提供理论依据。【方法】在溶液培养条件下,对20个紫花苜蓿品种的24 d龄的幼苗分别进行常磷(500μmol·L~(-1) KH2PO4)和低磷(5μmol·L~(-1) KH_2PO_4)处理,30 d后检测各品种的茎叶干重(SLW)、株高(PH)、根干重(RW)、根冠比(RS)、总根长(TRL)、根表面积(RSA)、全磷含量(TP)、磷利用率(PUE)、酸性磷酸酶活性(ACPA),并计算各指标的耐低磷系数。进一步对各指标的耐低磷系数进行相关性分析,并运用主成分分析、隶属函数分析、回归分析及聚类分析方法,综合评价不同品种耐低磷性及筛选与耐低磷密切相关的指标,同时建立耐低磷评价模型。【结果】低磷胁迫下,各品种紫花苜蓿的地上部分生长受到抑制,地下根系增大,全磷含量显著下降(P0.01)。通过主成分分析可将9个单项指标转化为4个新的相互独立的综合指标。进一步利用隶属函数对4个新的综合指标进行耐低磷综合评价,结合聚类分析结果,可将20个紫花苜蓿品种可分为三类,其中耐低磷较强的品种包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠;中度耐低磷品种包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801等9个品种;耐低磷较弱的品种包括巨能Ⅱ、中苜2号、康赛等7个品种。进一步利用逐步回归分析方法建立了紫花苜蓿耐低磷性评价数学模型D=-0.7997+0.3856SLW+0.2025PH+0.3789RW+0.1051TRL+0.4188TP+0.1347ACPA,方程的决定系数R~2=0.9982.【结论】通过分析紫花苜蓿不同品种的耐低磷能力,得出耐低磷较强的品种为敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠,与耐低磷性最相关的指标有茎叶干重、株高、根干重、总根长、全磷含量和酸性磷酸酶活性,可用于紫花苜蓿耐低磷性的评价筛选。     

水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR遗传多态分析

【目的】分析Pi-ta的3'-UTR区遗传变异与该基因抗性功能之间的关系,了解Pi-ta的抗性决定机制,为培养更持久的抗性品种提供依据。【方法】以遗传多样性极高的云南水稻地方品种为研究对象,收集了137个云南地方水稻品种。育苗后提取三叶一心期的水稻幼苗总DNA,设计引物扩增了Pi-ta的3'-UTR区的DNA序列,并扩增了关键功能位点6 640到终止密码子第6 675处这一段的DNA序列。通过双向序列测定获得了137条3'-UTR区的DNA序列并提交至Gen Bank,通过变异位点检测分析云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区的遗传多样性程度,并基于最大简约法构建单倍型网络图,分析不同单倍型之间的谱系关系。同时,联合编码区关键抗病位点6 640的碱基状态对3'-UTR单倍型的分布进行分析,讨论3'-UTR区与Pi-ta抗性功能之间的关系。【结果】云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区呈现出高度的遗传多样性,长度为1.1 kb的3'-UTR区共有12个SNP位点,由这些SNP可将137个品种划分成7个单倍型。不同单倍型之间没有重组的信号。Pi-ta的3'-UTR对应的DNA编码区长为1 120bp,是植物基因3'-UTR平均长度(200 bp)的5倍多,G+C含量相对较低,为40.43%,不存在插入或缺失导致的长度多态性。Pi-ta的3'-UTR序列中存在多个非保守的潜在poly A位点,此外,Pi-ta的3'-UTR区还存在非常高频率的TTTT序列,提示Pi-ta在转录终止时可能具有复杂的调控机制;而对Pi-ta的不同转录本的分析也表明3'-UTR对应于DNA编码区序列时呈现复杂多变的剪切方式,3'-UTR这种选择性拼接可能与抗性决定作用有关。对遗传多态的进一步分析表明,3'-UTR的SNP高度多态性都出现在感病品种中,所有抗性品种只共享一种单倍型。有趣的是,唯一的3'-UTR抗性单倍型与Pi-ta编码区唯一的抗性单倍型相对应,也即是6 640G所在单倍型也是3'-UTR唯一抗性单倍型。这表明3'-UTR与其编码区是紧密关联的,在功能上和所受到的选择压力方面是连续和一致的。Pi-ta的抗性单倍型区域已从编码区扩展到了3'-UTR区,在研制广谱抗性品种引入Pi-ta时需要同时保证其3'-UTR区不能有额外的SNP,必须是抗性单倍型特有的SNPs。【结论】Pi-ta的3'-UTR与其编码区紧密连锁,抗性品种的3'-UTR受到纯净化选择,维持单一单倍型,3'-UTR对于Pi-ta的抗性功能具有不可或缺的作用。     

基于转录组测序对紫花苜蓿细胞质雄性不育系相关代谢通路的鉴定

【目的】研究紫花苜蓿(Medicago sative L.)细胞质雄性不育(CMS)的机理,为紫花苜蓿利用不育系的育种工作提供理论基础。【方法】本研究以紫花苜蓿细胞质雄性不育系MSGN1A及其保持系MSGN1B为材料,进行转录组测序(RNA-Seq)以及基因功能注释,筛选与不育系机理相关的差异表达基因及代谢通路。【结果】Illumina测序共得到紫花苜蓿95 679条功能基因,经过差异表达分析筛选出187个显著差异表达的基因(DEGs),其中包括18个上调基因,169个下调基因。采用GO、KEGG、COG注释库分别对187个DEGs进行功能注释,其主要涉及催化活性、代谢活动、信号传导机制、合成、膜功能、碳水化合物运输和代谢、能量代谢等相关通路。【结论】筛选出与紫花苜蓿细胞质雄性不育性相关的代谢通路,初步探讨了紫花苜蓿细胞质雄性不育系的分子机理。     

施肥对洞庭湖平原水稻土团聚体特征及其有机碳分布的影响

【目的】团聚体是土壤重要的物理属性,也是土壤有机碳的主要固存场所。研究长期不同施肥对洞庭湖平原红壤性水稻土团聚体数量、稳定性、分形特征及其有机碳含量及分布的影响,为区域双季稻田施肥管理提供理论依据。【方法】以国家稻田土壤肥力与施肥效应长期试验为平台（1986—2013）,运用湿筛法获得不同粒级水稳性团聚体,分析对照（不施肥,CK）、单施氮磷钾肥（NPK）、低量有机肥与氮磷钾肥配施（LOM,有机肥氮比例为30%）和高量有机肥与氮磷钾肥配施（HOM,有机肥氮比例为60%）4种处理影响下耕作层（0—20 cm）土壤粒径＞0.25 mm的水稳性团聚体数量（WR_0.25）、平均重量直径（MWD）、几何平均直径（GMD）、分形维数（D）及其有机碳含量与分布的变化特征。【结果】除粒径＞5 mm的土壤团聚体外,水稳性团聚体含量和团聚体对土壤有机碳的贡献率均随团聚体粒径减小呈现逐渐增加的趋势,而团聚体有机碳含量则呈现逐渐降低的变化趋势,其变化特征在不同处理间表现一致。长期不同施肥对2—5 mm和0.5—2 mm团聚体含量影响最大,与对照相比,施肥处理中上述两粒级团聚体含量分别增加35.5%—64.5%和6.2%—14.7%。施肥后团聚体的WR_0.25、MWD、GMD分别增加8.6%—12.5%、7.1%—15.1%、13.7%—28.4%,而D值降低2.3%—3.5%,说明长期施肥增强团聚体稳定性,改善团聚体结构。单施氮磷钾肥和氮磷钾肥配施有机肥均可显著提高各粒级团聚体中有机碳含量（P＜0.05）,并始终表现出HOM强于LOM、LOM强于NPK的处理效应,与对照相比,HOM处理各级团聚体中有机碳含量较对照提高了22.1%—36.6%。水稳性大团聚体是土壤有机碳的主要载体,不同处理间＞0.25 mm团聚体中有机碳的分量占土壤有机碳的比例表现出HOM（83.5%）＞LOM（81.6%）＞NPK（79.2%）＞CK（69.9%）的顺序。施肥各处理均可显著提高＞5 mm、2—5 mm、0.5—2 mm三级团聚体中有机碳对土壤有机碳的贡献率,且主要影响土壤有机碳在2—5 mm和0.5—2 mm两级团聚体中的分配率。＞0.5 mm的各级团聚体含量与土壤有机碳含量呈极显著正相关（P＜0.01）,说明施肥后土壤新增有机碳主要向＞0.5 mm的水稳性团聚体中富集。【结论】长期实行NPK平衡施肥及与有机肥配施有利于洞庭湖平原红壤性水稻土水稳性团粒结构的形成及大团聚体中有机碳的积累,与单施氮磷钾肥处理相比较,施用有机肥特别是高量有机肥与化学氮磷钾肥配施更有利于土壤良好结构体的形成和固碳能力的增强,是更优的稻田施肥模式。     

赤霉素对根瘤菌运移、定殖及苜蓿幼苗生长的影响

【目的】研究赤霉素对荧光标记根瘤菌运移和定殖的动态及接种对甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa L.Gannong No.5)幼苗生长的影响,为增强根瘤菌向苜蓿体内尤其向繁殖器官转移并定殖的能力,促进苜蓿种植业发展提供理论依据和技术支持。【方法】分别向Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)和Ensifer meliloti 12531f(12531f)两种根瘤菌液内添加0.5、1、10和100 mg·L~(-1)赤霉素,测定第1、3、5、7和9天两种根瘤菌OD600吸光度值,同时将添加不同赤霉素的菌液分别浇灌于幼苗根部,于接种后第15、30、45和60天检测根瘤菌在根和地上各组织内运移和定殖及对苜蓿幼苗生长的情况。【结果】添加10 mg·L~(-1)赤霉素稍可促进12531f生长,但效果并不明显;而1 mg·L~(-1)赤霉素对gn5f生长初期效果较好,但随着时间的延长则无明显作用。10 mg·L~(-1)赤霉素促进12531f运移并定殖到下部茎、上部茎和上部叶内,1 mg·L~(-1)赤霉素促进gn5f运移并定殖到下部茎和下部叶内,以无菌水为对照的各组织内未检测到两种荧光标记根瘤菌。单独接种12531f和gn5f,均促进了叶绿素的形成,而添加赤霉素后接种均抑制了叶绿素的形成,但12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素、gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种可使幼苗单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上干重和根干重则均达最高。其中12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理75.71%和11.82%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理1 136.11%和55.05%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理113.94%和78.28%,差异显著(P0.05);株高分别高出对照和单独接菌处理83.33%和50.24%,差异显著(P0.05);根长分别高出对照和单独接菌处理115.28%和29.17%,差异显著(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理214.27%和206.43%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理1 156.19%和1 049.53%,差异显著(P0.05)。gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理82.86%和4.07%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理697.22%和105.00%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理32.12%和19.13%,株高分别高出对照和单独接菌处理95.24%和37.82%,根长分别高出对照和单独接菌处理76.39%和5.83%,但各处理间均无显著差异(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理125.98%和121.80%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理864.43%和762.21%,差异显著(P0.05)。【结论】分别添加10 mg·L~(-1)和1 mg·L~(-1)赤霉素后利于12531f和gn5f在苜蓿体内的运移和定殖并对结瘤、叶片生长、株高、根长、生物量均有促进作用,表明适宜赤霉素浓度可作为促进目标根瘤菌运移和定殖的方法,进而促进植株生长。     

撕裂蜡孔菌的新功能——防治茄子绵疫病及促生效应

【目的】生物农药和生物肥料安全性好,但种类较少,效果欠佳,亟需增加种类,提高药效和肥效。茄子是人们日常食用的大宗蔬菜,防治其病害,改善植物营养,提高产量和品质是亟待解决的生产问题。撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerate）分布广泛,起源复杂,功能多样,已用于医药、环保、生物能源等领域,论文进一步挖掘其农用功能。【方法】以自主分离获得的撕裂蜡孔菌新株HG2011为供试菌株,利用Bonnet液体培养基制备发酵液,谷壳、玉米粉和蛭石等制备固体菌剂,通过纯培养、拮抗、盆栽和田间试验,研究该菌株的胞外酶分泌,对辣椒疫霉（Phytophthora capsici)的拮抗效应、茄子绵疫病的防治效果,以及对茄子植株氮、磷、钾养分吸收和产量品质的影响。【结果】撕裂蜡孔菌HG2011菌株能分泌纤维素酶、β-1,3-葡聚酶、蛋白酶及磷酸酶,在发酵液中的活性分别为 46.11、63.02、199.33和27.25 U·mL^-1。在拮抗试验中,HG2011菌株发酵液显著抑制辣椒疫霉生长,抑制率为36.13%-60.59%;其菌丝还能侵入疫霉菌落,造成疫霉菌丝变形、断裂和消融。接种辣椒疫霉使盆栽茄子植株的发病率超过50%,病情指数为64.50;而在施用HG2011菌株发酵液的处理中,发病率为10.50%-18.52%,病情指数为13.46-20.60,防治效果为68.06%-79.13%,预防效果优于治疗效果。田间施用固体菌剂之后,茄子植株氮、磷、钾累积量和吸收效率最高,单施化肥次之,不施肥最低。与单施化肥相比,植株氮、磷、钾积累量分别增加30.99%-47.72%、19.97%-43.40%和11.21%-41.34%,吸收效率上升31.01%-47.74%、19.80%-43.40%和11.21%-41.34%,肥料偏生产力提高5.88%-18.43%、5.91%-18.44%和5.88%-18.43%,茄子植株生物量和果实产量的增幅分别达30.00%和16.06%。此外,施用固体菌剂显著提高茄子果实氮、维生素C、可溶性蛋白和游离氨基酸含量,比单施化肥依次增加13.86%-20.79%、62.46%-65.30%、36.30%-37.67%和25.46%-33.08%。【结论】撕裂蜡孔菌HG2011菌株抑制辣椒疫霉菌丝生长,使其变形、断裂和消融,降低茄子绵疫病的发病率和病情指数,预防效果优于治疗效果;田间施用撕裂蜡孔菌HG2011固体菌剂促进茄子植株吸收养分,刺激生长,提高产量,改善品质。因此,撕裂蜡孔菌新株HG2011及新作用¾¾防病促生效应的发现扩展了其生物学功能,丰富了生防菌及促生菌的种质资源库,具有潜在的应用前景。     

拟南芥仅含START结构域亚家族基因特性与功能分析

【目的】分析拟南芥中仅含START结构域(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)亚家族成员的启动子元件及表达特性,阐明启动子元件与表达特性的相互关系,为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能,解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件,对启动子元件的功能进行分析和分类;利用real-time PCR方法研究亚家族成员的表达特性;用突变体分析确认基因的功能;分析通过启动子元件分析预测的基因功能与通过突变体分析确认的基因功能间的相关性,为基因的功能和作用机制分析提供科研思路和方法。【结果】生物信息学分析表明,拟南芥中仅含START结构域亚家族成员共6个,分为3个分支,每个分支一对基因,每一对基因中均有一个基因的启动子中含有高转录水平元件5′UTR Py-rich stretch,6个亚家族成员的启动子区均含有多个光、激素和逆境响应元件,也存在各自特异的响应元件;用real-time PCR分析基因的表达量,结果与生物信息学预测结果一致:At3g13062的表达量明显高于同分支的At1g55960,At3g23080的表达量明显高于同分支的At4g14500,At1g64720的表达量明显高于同分支的At5g54170。组织定位分析表明亚家族成员有特异的时空表达特性:At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明显表达,但At3g13062主要在子叶、下胚轴和根中表达,而At1g55960主要在根中表达量较多;在成苗期拟南芥中,At3g13062主要在叶片中表达,在根中表达量较少;而At1g55960在成苗期拟南芥的叶片和根系的表达量均较多;At3g23080和At4g14500在幼苗期表达量较少,而在成苗期表达量增加,At3g23080主要分布于莲座叶中,At4g14500主要分布于莲座叶叶柄部。上述结果表明仅含START结构域亚家族成员可能在拟南芥不同时期和不同的部位分别行使着功能。利用生物信息学对启动子元件分析发现,各个基因均具有胚乳特意表达的Skn-1 motif元件,暗示着该家族基因可能参与调控胚乳的发育,进而影响种子的活力和萌发;通过对At3g23080和At4g14500的T-DNA插入突变体种子的分析表明,At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率的下降,这与生物信息学预测结果一致。【结论】拟南芥中仅含START结构域的亚家族有6个成员;6个亚家族成员可能在光、激素和逆境调控的发育过程中具有重要的作用;含START结构域的亚家族6个成员虽然同源关系较近,但具有各自的时空表达特性,在拟南芥的不同组织和不同发育时期执行着各自的功能。基因启动子元件与基因功能有直接关系,启动子区具有胚乳特意表达Skn-1 motif元件的At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率下降。     

灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

【目的】明确灰葡萄孢（Botrytis cinerea）犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径之间的关系,为进一步阐明BcKMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO对cAMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO中的cAMP,利用HPLC检测各菌株中cAMP的含量;利用real-time PCR技术检测BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pkaR、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测BcKMO突变体中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变中BcKMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183对cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,BcKMO和cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pkaR、bcg3的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显低于野生型。【结论】BcKMO负调控cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达;cAMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控BcKMO的表达,而cAMP信号途径关键基因pka2、pkaR、bcg3正调控BcKMO的表达。     

拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型,分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点,比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点;以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针,明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置,测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数;通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上,在小麦的B组染色体上仅有零星分布,在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上,在小麦的A、D组染色体中分布较少,但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点,可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似,而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大,甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列,不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析,可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体,并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。