同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒／板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统。以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段。为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响，利用一段5．4kb板栗疫病菌染色体DNA序列，构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒，分别转化板栗疫病菌EPl55原生质体，检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率。结果表明，在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1（1．7～2.0kb）、FHA2（1.0～1.2kb）和FHA3（0.5kb）的同源重组频率分别为3．73％、2。06％和0；3个同源单交换质粒pFHl（1．76kb）、pFH2（1．23kb）和pFH3（O．54kb）的同源重组频率分别为0.95％、0和0。这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据。     

板栗疫病菌低毒力遗传转化株LC的构建

低毒病毒—板栗疫病菌组合是研究病毒—宿主相互作用的模式系统之一。通过构建含板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA和苯菌灵抗性基因的表达质粒pXB3F2,并用于转化野生型无毒株EP155,获得了以苯菌灵抗性为筛选标记、具有dsRNA病毒再生能力的低毒力遗传转化株LC,为深入研究病毒—真核宿主相互作用的分子机制提供了新的研究材料。     

一种用于板栗疫病菌基因打靶系统的新型抗性筛选标记

板栗疫病菌是研究病原真菌的模式物种之一。目前应用于板栗疫病菌遗传转化的筛选标记有潮霉素、苯菌灵和G418抗性基因。随着板栗疫病菌致病分子机理研究的深入,需要更多的遗传筛选标记用于多重基因的遗传转化分析。本研究通过融合PCR技术,成功利用博莱霉素抗性基因Bleor进行了板栗疫病菌高丰度分泌表达基因的打靶实验,证实了Bleor作为板栗疫病菌基因筛选标记的可行性。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒/板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统.以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段.为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响,利用一段5.4 kb板栗疫病菌染色体DNA序列,构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒,分别转化板栗疫病菌EP155原生质体,检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率.结果表明,在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1 (1.7～2.0 kb)、FHA2 (1.0～1.2 kb)和FHA3 (0.5 kb)的同源重组频率分别为3.73% 、2.06%和0;3个同源单交换质粒pFH1 (1.76 kb)、pFH2 (1.23 kb)和pFH3(0.54 kb)的同源重组频率分别为0.95% 、0和0.这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据.     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒。感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降。低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒。利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,己获得了一些很有意义的发现。本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制。低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统。     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

低毒病毒-板栗疫病菌系统作为抗正链RNA病毒化合物筛选模型的研究

板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）是引起板栗疫病的病原真菌。低毒病毒是一类侵染板栗疫病菌的无衣壳正链RNA病毒。无病毒栗疫病菌野生型菌株在PDA培养基上形成桔黄色菌落,而带毒株在则形成白色菌落。本研究利用已知的不同机制的抗病毒药物处理无病毒和感染病毒的板栗疫病菌菌株,观察菌丝体颜色变化并检测菌丝体中病毒双链RNA（dsRNA）的含量。结果显示,抗病毒药物处理后,带毒株系EP721和Euro7的菌丝体颜色表型发生明显变化,且病毒dsRNA累积量与菌丝体颜色变化存在明显相关性：随着药物浓度增大,菌丝体颜色加深,病毒dsRNA积累量下降。因此,可以根据菌株颜色的变化判断药物对病毒复制或症状表现是否有效,从而极大简化抗RNA病毒药物的初步筛选过程。     

在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

p29蛋白是低毒病毒基因组编码的一个木瓜蛋白酶样蛋白。前人研究发现,在宿主板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）体内表达p29,会引起真菌毒力降低,色素产生减少,丧失产生无性孢子的能力。除已知p29与源于高尔基体的膜结构共分离之外,p29在细胞内的其它分布形式未明。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上,尝试用p29抗体检测线粒体中是否存在p29蛋白。Western印迹结果表明,受CHV1-EP713感染的EP713菌株线粒体中存在与p29抗体特异作用的病毒蛋白。本研究结果暗示,低毒病毒蛋白p29可能参与调控宿主线粒体功能。     

大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除

低毒病毒/板栗疫病菌是一个研究病毒宿主相互作用的优良的实验系统.为了更好的了解病毒与宿主相互作用的机制,我们建立了一个野生型无病毒板栗疫病菌菌株EP155和受低毒病毒感染的菌株EP713的cDNA混和文库,以进行表达序列标签（EST）测定.对543个克隆的外源片段的分析表明,该文库克隆中含外源片段的比例为89.8%;通过小规模测序,发现空质粒与小片段克隆占测序总数的10.1%;表达丰度最高的4个克隆出现次数的总和占测序总数的9.6%.通过设计引物进行PCR和原位杂交,对cDNA文库2万多个克隆进行了筛选,共筛除了占总数19.7%的空质粒与小克隆和5.5%的高丰度克隆,为高效率的大规模EST测序准备了条件.     

适用于板栗疫病菌分子相互作用研究的双分子荧光互补系统

双分子荧光互补技术近年来已广泛应用于研究体内蛋白质相互作用。为建立适合于板栗疫病菌的体内蛋白质相互作用检测体系,本研究以质粒pCPXHY2和pCPXG418为骨架,构建了由板栗疫病菌pgd启动子控制的、以增强型黄色荧光蛋白EYFP为报告基因和以潮霉素和G418抗性为选择标记的双质粒系统pCPXHY2N155和pCPXG418C156。质粒pCPXHY2N155携带EYFP的1~155位氨基酸残基的编码序列,pCPXG418C156携带EYFP基因的156~239位氨基酸残基的编码序列。为验证该质粒系统的有效性,将板栗疫病菌异质三联体G蛋白的β和γ亚基基因分别与pCPXHY2N155上的N155和pCPXG418C156上的C156相连,获得重组质粒pCPXHY2N155β和pCPXG418C156γ。将这两个重组质粒共转化板栗疫病菌野生型菌株EP155,在转化株中观察到明显的黄色荧光,表明Gβ和Gγ在细胞中发生了相互作用。本研究所构建的双分子荧光互补系统,为今后研究板栗疫病菌分子相互作用提供了新的技术手段。     

利用ISSR分析栗疫病菌群体遗传多样性

本研究利用ISSR分子标记技术,对中国、日本、意大利及美国等四个栗疫病菌群体的遗传多样性和遗传分化进行了分析。自53个ISSR引物中筛选出11个引物,对以上四个群体的栗疫病菌11个子群体的220个菌株进行扩增,共检测到177个位点,其中多态位点为174个,多态位点百分率（P）为98.31%。11个栗疫病菌子群体的P平均值为20.43%;群体水平的Shannon信息指数（I）和Nei指数（h）分别为0.1769和0.7386;各个子群体I的平均值为0.0943,h的平均值为0.0614。比较表明,中、日、意、美栗疫病菌群体间具有较高的遗传多样性。栗疫病菌群体间的基因分化系数（Gst）为0.7386,其基因流（Nm）为0.1769,11个子群体间的遗传距离平均为0.2289。利用算术平均数的非加权成组配对法（UPGMA）对栗疫病菌11个子群体进行聚类,结果可分为3大类群。