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毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长
引用本文:张凤雪,徐英武,张智俊,肖冬长,王超莉,屈亚平.毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长[J].浙江农林大学学报,2014,31(4):515-520.
作者姓名:张凤雪  徐英武  张智俊  肖冬长  王超莉  屈亚平
作者单位:浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,浙江 临安 311300
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31270715);浙江农林大学科研发展基金资助项目(2010FR072)
摘    要:3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。

关 键 词:林木育种学  毛竹  脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶  组织特异性表达  原核表达  蛋白纯化  结晶
收稿时间:2013-10-21;

Expression,purification, and crystallization of KDO8PS fromPhyllostachys edulis
ZHANG Fengxue,XU Yingwu,ZHANG Zhijun,XIAO Dongchang,WANG Chaoli,QU Yaping.Expression,purification, and crystallization of KDO8PS fromPhyllostachys edulis[J].Journal of Zhejiang A&F University,2014,31(4):515-520.
Authors:ZHANG Fengxue  XU Yingwu  ZHANG Zhijun  XIAO Dongchang  WANG Chaoli  QU Yaping
Affiliation:The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300,Zhejiang,China
Abstract:
Keywords:forest tree breeding  Phyllostachys edulis  3-deoxy-D-manno-octulosonate (KD0)8-phosphate synthase (KDO8PS)  tissue  specific expression  prokaryotic expression  protein crystallization  crystal
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