| 小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7~(TLR3-/-)细胞系的建立 |
| |
| 引用本文： | 韦显凯,覃晴,祝健,唐海波,梁晶晶,李晓宁,罗廷荣.小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7~(TLR3-/-)细胞系的建立[J].南方农业学报,2018(5). |
| |
| 作者姓名： | 韦显凯 覃晴 祝健 唐海波 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 |
| |
| 作者单位： | 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室;广西大学动物科学技术学院;广西动物疫病预防控制中心 |
| |
| 摘 要： | 【目的】建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。【方法】采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体p TALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性。【结果】TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性。T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp)。TALEN打靶载体p TALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/m L G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活。【结论】通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究。
|
| 本文献已被 CNKI 等数据库收录！ |
|
